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上期，我們盤點(diǎn)了吸收光、熒光強(qiáng)度、發(fā)光檢測及熒光偏振檢測技術(shù)。本期，筆者繼續(xù)為大家盤點(diǎn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移、時間分辨熒光、Alpha檢測等5種酶標(biāo)儀檢測技術(shù)。

5.熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET）

1948年，Foster首次提出熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）理論，指兩個熒光基團(tuán)間能量通過偶極-偶極耦合作用以非輻射方式從供體(Donor)傳遞給受體(acceptor)的現(xiàn)象。

想要實現(xiàn)FRET，熒光供體和受體分子必須滿足以下幾個前提條件：

（1）供體分子的發(fā)射光譜和受體分子的吸收光譜須有一定程度的重疊，一般大于30%(重疊越多，FRET效果越好）；

（2）供體分子和受體分子間的距離須小于10nm（一般為7～10nm）；

（3）供體分子和受體分子的共振方向須平行或近似平行。FRET主流的熒光探針主要有三種：熒光蛋白、傳統(tǒng)有機(jī)分子和鑭系元素。

典型應(yīng)用：蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象改變、蛋白的空間分布和組裝、受體/配體相互作用、核酸結(jié)構(gòu)和構(gòu)象改變、脂類的分布和轉(zhuǎn)運(yùn)、膜蛋白的研究、核酸檢測等應(yīng)用。

6.生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer,BRET）

生物發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移（BRET）檢測原理與FRET類似，不同的是供體產(chǎn)生生物發(fā)光來激發(fā)受體熒光分子，無需激發(fā)光，背景更低，也避免了光漂白和自發(fā)熒光等問題。

BRET于1999年首次報道，但由于使用熒光素酶導(dǎo)致信號強(qiáng)不足，因此BRET檢測的靈敏度和動態(tài)范圍較低。2015年，Promega公司完成了重大技術(shù)升級，將BRET技術(shù)帶入了一個新的階段：NanoBRET。與傳統(tǒng)BRET檢測相比，NanoBRET檢測獲得的光譜疊加更佳、信號更強(qiáng)且背景更低。典型應(yīng)用：活細(xì)胞中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。

7.時間分辨熒光（Time-resolved fluorescence,TRF）

時間分辨熒光（TRF）是一種高級熒光檢測技術(shù)，使用鑭系金屬做熒光標(biāo)記（其熒光比普通熒光持續(xù)時間更長，普通熒光的半衰期為納秒級，鑭系元素的半衰期是毫秒級。），利用熒光分子之間熒光壽命的差異來分離所需的熒光信號。與傳統(tǒng)熒光檢測方法相比，TRF具有靈敏度高、樣品制備簡單、檢測重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。

常規(guī)TRF技術(shù)包括熒光壽命成像（Fluorescence Lifetime Imaging，FLIM）技術(shù)和時間分辨熒光免疫分析（Time-Resolved Fluoroimmunoassay，TRFIA）技術(shù)。其中TRFIA技術(shù)是將時間分辨熒光與免疫分析技術(shù)相結(jié)合，以三價鑭系元素離子或其螯合物，例如銪（Eu）、鋱（Tb）、釤（Sm）和鏑（Dy）為標(biāo)記物，來代替常用的熒光物質(zhì)對抗原抗體進(jìn)行標(biāo)記，并使用帶有時間分辨熒光檢測功能的儀器（如酶標(biāo)儀）來對熒光強(qiáng)度信號進(jìn)行檢測，最終繪制標(biāo)準(zhǔn)熒光曲線，定量分析待測物的濃度。

典型應(yīng)用：GPCR測定、激酶測定、細(xì)胞因子和生物標(biāo)志物檢測、細(xì)胞代謝、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、受體-配體相互作用、藥物發(fā)現(xiàn)、高通量篩選等。

8.均相時間分辨熒光（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence,HTRF）

均相時間分辨熒光（HTRF）是基于TRFIA技術(shù)衍生出的新技術(shù)，將TRF技術(shù)和FRET技術(shù)相結(jié)合，能量供體選擇鑭系元素銪（Eu）和鋱（Tb）的穴狀化合物，交聯(lián)別藻藍(lán)蛋白（cross-linked APC）或小分子熒光探針d2）作為受體，當(dāng)供體和受體距離足夠近時，供體被一個能量源激發(fā)，可以引發(fā)能量轉(zhuǎn)移到受體，使其在特定波長發(fā)出熒光，用于檢測生物分子之間的相互作用。

檢測時，通過延緩檢測時間，讓短壽命的熒光衰變掉后，再檢測熒光強(qiáng)度，消除背景熒光的干擾。同時HTRF技術(shù)在均相（溶液）中一步反應(yīng)，無需包被、封閉、洗滌等繁瑣的操作步驟。因此該技術(shù)具有背景低、特異性好、操作簡單、體系穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。典型應(yīng)用：GPCRs配體結(jié)合、細(xì)胞水平的蛋白激酶實驗、蛋白磷酸化、生物治療藥物研發(fā)、蛋白互作、生物因子或者趨化因子等。

9.放大化學(xué)發(fā)光親和均相檢測（AmplifiedLuminescent Proximity Homogeneous Assay Screen，AlphaScreen）

放大化學(xué)發(fā)光親和均相檢測（AlphaScreen）是基于Ullman在1994年開發(fā)的LOCI (Luminescent Oxygen Channeling Assay)技術(shù)發(fā)展而來。簡單來說，AlphaScreen是以微珠為基礎(chǔ)的勻相發(fā)光能量轉(zhuǎn)移技術(shù)。人們習(xí)慣性將AlphaScreen技術(shù)和AlphaLisa技術(shù)統(tǒng)稱為ALPHA技術(shù)。

AlphaScreen技術(shù)需要兩個由不同的化學(xué)混合物組成的微珠，分別為供體微珠（Donor beads）和受體微珠（Acceptor beads）。其中供體微珠包含了光敏劑苯二甲藍(lán)(Phthalocyanine)，在680nm激光的照射下，它周圍環(huán)境中的氧分子轉(zhuǎn)化成一種高能活躍的氧狀態(tài)-單體氧(Singlet Oxygen)。單體氧可以在溶液中擴(kuò)散高達(dá)200nm的距離。如果在該范圍內(nèi)存在受體微珠，單體氧就會觸發(fā)受體微珠的二甲基噻吩衍生物，繼而通過激發(fā)一系列的化學(xué)反應(yīng)，最終在520-620nm產(chǎn)生光信號，從而達(dá)到檢測目的。